Jeg vil gerne starte med en påmindelse, der ofte går tabt i offentlige diskussioner: Covid mRNA-vaccinerne er virkelig nye medicinske produkter.
Før nødgodkendelserne i 2020 var mRNA-vaccineteknologi aldrig blevet anvendt i stor skala på mennesker. Kun to kliniske forsøg, et fra Pfizer-BioNTech og et fra Moderna, havde nogensinde testet denne platform på mennesker. I alt havde omkring 37,000 personer nogensinde modtaget en mRNA-vaccine i medicinens historie (eksklusive de tidligere erfaringer med rabies-, CMV- og kræftvacciner, der var begrænset til meget mindre tidligfasestudier). Det er ikke en kritik; det er blot en konstatering af fakta. Men det betyder, at den langsigtede sikkerhedsprofil for disse produkter var og fortsat er ufuldstændigt forstået.
Det følgende er velkendt for næsten alle molekylærbiologer. Det er kompliceret, men jeg forsøger at forenkle det i betragtning af indsatsen. Det er vigtigt at tydeligt definere den molekylære ramme for alle, fordi hvordan disse vacciner fremstilles, direkte bestemmer, hvad der er inde i hætteglasset.. Og det, der er inde i hætteglasset, vil, når det er injiceret, rejse gennem kroppen og aktivere en kaskade af begivenheder, der kan føre til langsigtede helbredsmæssige konsekvenser.
In vitro-transkription er ikke kun en produktionsdetalje
Modificerede mRNA-vacciner produceres ved hjælp af en proces kaldet in vitro-transkription (IVT))IVT er den metode, der bruges til at syntetisere det modificerede mRNA, som i sidste ende bliver den aktive ingrediens i vaccinen.
Dette er ikke en triviel teknikalitet. IVT former fundamentalt den molekylære sammensætning af det endelige produkt.
Forskere hos BioNTech, herunder dem der er direkte involveret i udviklingen af Pfizer-vaccinen, har offentliggjort en detaljeret gennemgang1 der beskriver, hvordan IVT-reaktioner ikke kun genererer det tilsigtede mRNA i fuld længde, men også en række biprodukter og urenheder, hvordan disse typisk fjernes, og hvad deres biologiske konsekvenser kan være, hvis de fortsætter. Disse fremstillingsretninger sammen med de biprodukter, de skaber, blev også beskrevet detaljeret af Moderna i deres patenter (US10,653,712 B2 og US10,077,439 B2). Men endnu vigtigere er det, at denne molekylærbiologi var veletableret længe før Covid. Intet af dette er spekulativt.
Udgangsmaterialet: DNA-skabeloner
I sin kerne begynder en IVT-reaktion med dobbeltstrenget DNA, der koder for det ønskede protein. I dette tilfælde SARS-CoV-2 spike-proteinet.
Den spike-kodende sekvens, der anvendes i mRNA-vacciner, er genetisk modificerede for at forbedre stabilitet og cellulær tolerance, herunder to aminosyresubstitutioner, der adskiller den fra den virale spike. Denne modifikation er forsætlig.
Selve DNA-skabelonen kan antage forskellige former. Under Pfizers tidlige kliniske forsøg blev PCR-genererede DNA-fragmenter anvendt. Den kommercielle fremstillingsproces var dog afhængig af DNA afledt af plasmider. Dette er vigtigt, fordi plasmider indeholder yderligere regulatoriske sekvenser. I Pfizers tilfælde omfatter disse elementer som SV40-promotor og ori-sekvenser, hvilket giver anledning til bekymring, hvis de skulle trænge ind i humane celler.
Når denne DNA-skabelon er tilføjet til IVT-reaktionen, sammen med RNA-polymerase og andre komponenter, transkriberes den til mRNA (figur 1).
IVT producerer biprodukter efter design
Mens det ønskede output fra IVT er det tilsigtede mRNA-produkt i fuld længde, er det faktiske output mere komplekst. Disse omfatter forskellige biprodukter i form af (1) forskellige RNA-arter, herunder dobbeltstrenget RNA (dsRNA), (2) DNA bundet til RNA (RNA-DNA-hybrider), og (3) det frie DNA fra den oprindelige skabelon (Figur 2).
Dannelsen af disse biprodukter er veldokumenteret og uundgåelig, og derfor er downstream-rensning absolut afgørende for sikkerheden.
Figur 2. Biprodukter og forurenende stoffer fra IVT-produktion. Billede tilpasset fra 1.
Rensning har kendte begrænsninger
Efter fremstillingen er der to oprensningstrin, der er nødvendige for først at fjerne DNA'et og derefter fjerne RNA-biprodukterne (figur 3):
Figur 3. Fjernelse af IVT-biprodukter. Billede tilpasset fra 2.
For at fjerne DNA'et tilsættes et enzym kaldet DNase I til reaktionsblandingen, som almindeligvis bruges til at nedbryde forurenende DNA. Selvom DNase I er effektiv mod det frie skabelon-DNA, viser flere undersøgelser, herunder arbejde udført af BioNTech-forskere selv, at DNase I er ineffektiv til at fjerne DNA'et bundet til RNA (RNA-DNA-hybrider).
Denne begrænsning er ikke kontroversiel. Den er dokumenteret i litteraturen.
Hvad uafhængige analyser har vist
Denne kontekst er afgørende for at fortolke nylige uafhængige analyser af færdige vaccinehætteglas.
Forskere3 og regulatorer4 har rapporteret at have detekteret DNA-kontaminanter i stort set alle testede hætteglas. Disse kontaminanter omfattede både dobbeltstrenget DNA og RNA-DNA-hybrider, der syntes resistente over for DNase I-fordøjelse.
I nogle prøver var spike-kodende DNA til stede i niveauer, der var mere end 100 gange højere end andre plasmidsekvenser.5, hvilket tyder på ujævn eller ufuldstændig fordøjelse. Sekventering og kvantitative PCR-analyser påviste yderligere DNA-fragmenter med en gennemsnitlig længde på ~200 basepar, hvoraf nogle oversteg 4 kilobaser. I flere tilfælde blev der observeret sekvenser, der spændte over næsten hele plasmidet.
Samlet set rejser disse resultater alvorlige spørgsmål om konsistensen og fuldstændigheden af oprensningen under storskalaproduktion, og om de potentielle biologiske konsekvenser af resterende nukleinsyrer hos mennesker.
Hvorfor nukleinsyreforurenende stoffer er biologisk vigtige
RNA og DNA er potente aktivatorer af medfødte immunforsvarsveje. Dette er ikke spekulativt. Mønstergenkendelsesreceptorer og cGAS-STING-signalvejen reagerer robust på fremmede nukleinsyrer, hvilket udløser inflammation, væksthæmning og endda celledød.
Disse mekanismer er netop grunden til, at genterapiprodukter er underlagt streng sikkerhedsovervågning.
Ironisk nok blev Covid mRNA-vaccinerne designet med modifikationer specifikt for at reducere denne potente medfødte immunaktivering. Men RNA-DNA-hybrider og DNA-fragmenter vil stadig fremkalde stærke immunresponser på trods af disse modifikationer.
Vedholdenhed rejser nye spørgsmål
Der er nu betydelig evidens for, at spike-mRNA og -protein forbliver i humant væv i uger, måneder og endda år efter vaccination (Tabel 1).
Vi ved endnu ikke, om denne persistens afspejler forlænget mRNA-stabilitet, fortsat translation eller DNA-baserede mekanismer. Men givet sandsynligheden af DNA-integration og langlivet ikke-integreret plasmid-DNA i muskelceller,6 Det er ikke urimeligt at antage, at persistensen af Spike mRNA, protein og antistoffer mod Spike i årevis efter vaccination ikke er uafhængig af DNA-urenheder og biprodukter efter IVT.
Tabel 1. Spike mRNA og proteinpersistens efter vaccination hos mennesker
Kort- og langsigtede sikkerhedsmæssige konsekvenser
Samlet set giver disse data anledning til adskillige vigtige sikkerhedsmæssige overvejelser.
For det første er der rapporteret om akutte immunreaktioner, herunder cytokinstorme og anafylaksi, umiddelbart efter vaccination. Sådanne stærke inflammatoriske reaktioner bør ikke afvises direkte som værende uafhængige af urenheder, især i betragtning af den viden, der er om nukleinsyreinduceret immunaktivering.
For det andet, og mere kritisk, er der langsigtede risici. Vedvarende spike-ekspression kan sandsynligvis bidrage til kroniske immunsyndromer. Endnu mere bekymrende er muligheden for DNA-integration, som indebærer risiko for insertionsmutagenese eller genforstyrrelse. Dette betyder en risiko for kræft eller udviklingsdefekter afhængigt af hvor og i hvilken alder DNA'et blev integreret.
Især FDA angiver selv i sine informationsblade, at disse vacciner ikke har blevet evalueret for kræftfremkaldende egenskaber (kræftdannelse) eller genotoksicitet (DNA-skade), et punkt, der ville være rutinemæssigt og forventet i forbindelse med tilsyn med genterapi, hvor langtidsovervågning er standard.
Det regulatoriske hul omkring DNA i mRNA-vacciner
Da der reelt ikke længere er nogen tvivl om, at der findes resterende DNA i mRNA-vacciner, er spørgsmålet, om de nuværende retningslinjer og sikkerhedsgrænser er passende for mRNA-vacciner. Vi er blevet forsikret om, at DNA-biprodukterne er inden for de grænser, der er fastsat i de lovgivningsmæssige retningslinjer. Så hvad er FDA's vejledning omkring DNA-biprodukter og forurenende stoffer?
Den mest almindeligt citerede FDA-vejledning om rest-DNA (≤10 ng pr. dosis) blev udviklet til virale vacciner produceret i levende celler, der er fragmenterede og "nøgne" med begrænset evne til at trænge ind i humane celler. mRNA-vacciner produceres dog ikke i celler, deres rest-DNA er ikke værtscelleafledt, og vigtigst af alt er DNA'et i mRNA-vaccinerne ikke nøgent. Det er forbundet med LNP-leveringssystemer, som specifikt gør det meget nemt for DNA'et at trænge ind i celler. FDA's vejledning fra 2010 er klar om, at den ikke fastsætter en relevant sikkerhedstærskel for DNA forbundet med LNP-baserede produkter.
Den anden almindeligt citerede vejledning er fra WHO for rekombinante proteinterapeutika, der omhandler resterende DNA i produkter såsom monoklonale antistoffer eller hormoner produceret i genmodificerede celler. Igen stammer det resterende DNA fra værtsceller eller ekspressionsplasmider, er til stede som spor af ikke-indkapslet DNA (nøgent), og slutproduktet er et oprenset protein, ikke en nukleinsyrebaseret terapi (mRNA-vaccine). Så denne vejledning gælder ikke for mRNA-vacciner.
Hverken FDA- eller WHO-regulatoriske standarder, der oftest citeres for rest-DNA, blev udviklet til mRNA-vacciner, og adresserer ikke direkte dette sikkerhedsproblem.
Hvad WHO sagde om mRNA-vacciner — efter implementering
I 2022 udstedte Verdenssundhedsorganisationen en vejledning specifikt om mRNA-vacciner7Det er værd at bemærke, at dette dokument blev frigivet efter den globale udrulning af disse produkter. Det anføres specifikt, at denne vejledning var et svar på: “de sikkerheds-, produktions- og regulatoriske problemer, der er forbundet med denne nye teknologi.Dokumentet indeholder også flere vigtige udtalelser:
"Da der endnu ikke findes detaljerede oplysninger om de anvendte produktionsmetoder, kontrollerne endnu ikke er standardiserede for sikre og effektive mRNA-vacciner, og visse detaljer forbliver fortrolige og dermed ikke offentligt tilgængelige, er det ikke muligt at udvikle specifikke internationale retningslinjer eller anbefalinger på nuværende tidspunkt."
Det står videre: “De detaljerede produktions- og kontrolprocedurer ... bør drøftes med og godkendes af den nationale tilsynsmyndighed [NRA].] på individuelt grundlag fra sag til sag."
WHO anerkender, at kontrollen af mRNA-vacciner endnu ikke var standardiseret, og at det ikke var muligt at fastlægge specifikke internationale retningslinjer eller anbefalinger. Derudover kræves der myndighedstilsyn for at nationale myndigheder kan foretage en individuel vurdering.
Dette blev sagt efter at mRNA-vaccinerne var blevet udsendt.
Og på tidspunktet for skrivningen af denne del af vaccinen har FDA stadig ikke etableret standardiserede retningslinjer for mRNA-vacciner og fremlagt nogen evidens og sikkerhedsbaserede data, der understøtter eventuelle begrænsninger af DNA i mRNA-vacciner.
Endelig er det værd at gentage: Selvom mRNA-teknologi ikke er ny, blev den før Covid reguleret som genterapi, ikke som en traditionel vaccine. Sikkerhedsproblemerne omkring DNA-biprodukterne i Covid-vacciner vil være de samme med enhver mRNA-vaccine, inklusive dem mod influenza, RSV eller endda mRNA-vacciner mod kræft.
Dette skyldes, at mRNA-produkter er fundamentalt forskellige. De skal trænge ind i cellerne og instruere dem i at producere et fremmed protein. Dette er ulig andre konventionelle vacciner, der leverer proteinet direkte. Der er ingen klinisk præcedens for denne platform, og der er ingen klinisk præcedens for gentagen dosering. Og bestemt ingen præcedens på populationsniveau.
På nuværende tidspunkt, uden pandemi, med akkumulerende mekanistiske data og kliniske observationer samt spredningen af mRNA-vaccineprodukter, der kommer på markedet, har vi brug for gennemsigtighed og direkte engagement i seriøse sikkerhedsstudier fra regulatorer, især FDA, der fastlægger kritiske retningslinjer for fremstilling af disse produkter – især hvad angår DNA-biprodukter.
Ny teknologi kræver ny granskning – ikke tavshed, gaslighting eller censur.
Referencer
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S, et al. Mol Pharm. 4. april 2022;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang et al. (2004) – “Detektion af integration af plasmid-DNA i værtens genomiske DNA efter intramuskulær injektion og elektroporation” (Gene Therapy, 2004). Hos mus blev nøgent plasmid-DNA injiceret intramuskulært, efterfulgt af elektroporation for at forbedre optagelsen. Ved hjælp af en yderst følsom PCR på oprenset genomisk DNA (med gelseparation for at fjerne ekstrakromosomale former) identificerede forfatterne fire uafhængige integrationshændelser 4 uger efter injektion. Junction-sekventering bekræftede tilfældige integrationssteder (ingen præferentielle hotspots), hvilket var i overensstemmelse med ikke-homolog endesammenføjning. Integrationsfrekvensen var lav, men målbar. Dette er en af de klareste demonstrationer af faktiske spontane integrationshændelser in vivo for nøgent plasmid-DNA i muskler. Det er værd at bemærke, at denne undersøgelse anvendte forbedret DNA-levering via elektroporation, hvilket kunne sammenlignes med den forbedrede levering via LNP'er.
Martin et al. (1999) – “Plasmid DNA Malaria Vaccine: The Potential for Genomic Integration after Intramuscular Injection” (Human Gene Therapy). Dette tidligere studie testede plasmid-DNA IM hos mus og brugte Southern blot-hybridisering og PCR på højmolekylært genomisk DNA til at undersøge integrationen. Selvom persistensen for det meste var ekstrakromosomal, rapporterede de tegn på sjælden integration i nogle prøver (dog ikke så definitivt sekventeret som senere arbejder). Det satte en benchmark for lav risiko, men anerkendte potentialet for meget lavfrekvente hændelser, hvilket påvirkede efterfølgende FDA-vejledning om DNA-vacciner.
Ledwith et al. (2000) – “Plasmid-DNA-vacciner: Undersøgelse af integration i værtens cellulære DNA efter intramuskulær injektion hos mus” (Intervirology). Nøgent plasmid-DNA injiceret IM i mus viste, og selvom der ikke blev observeret nogen detekterbar integration, blev DNA stadig detekteret i quadriceps-musklen i op til 26 uger. DNA'et var ekstrakromosomalt.
7 WHO's ekspertkomité for biologisk standardisering, 74. rapport, bilag 3. Evaluering af kvaliteten, sikkerheden og effektiviteten af messenger-RNA-vacciner til forebyggelse af infektionssygdomme: regulatoriske overvejelser https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
-
Dr. Charlotte Kuperwasser er en fremtrædende professor ved Institut for Udviklings-, Molekylær- og Kemisk Biologi på Tufts University School of Medicine og direktør for Tufts Convergence Laboratory på Tufts. Dr. Kuperwasser er internationalt anerkendt for sin ekspertise inden for brystkirtelbiologi og brystkræft samt forebyggelse. Hun er medlem af det rådgivende udvalg for immuniseringspraksis.
Vis alle indlæg
